酚類化合物的去除

酚類化合物的去除 

 
經過Li+或Ca2+沉澱RNA的辦法可以將未被氧氣化的酚類化合物去除。與PVP、不溶性PVPP或BSA接合的多酚，可以直接經過離心去洗雪，或在苯酚、氯仿抽提時去掉除掉。在利用高液體濃度的2-丁氧氣酒精（50****）來沉澱RNA時，因為多酚溶解於2-丁氧氣酒精中而被去掉除掉。而後用含50**** 2-丁氧氣酒精的緩和衝突液蕩滌RNA沉澱以去除**的多酚。因為這個縱然多酚被氧氣化，其氧氣化產物仍可以溶解在高液體濃度2-丁氧氣酒精溶液中而被去除，無須再用NaBH4來處置。

多糖的乾擾及對策

多糖的汙染是提出取得植物RNA時不時碰到的另一個棘手的問題。植物團體中往往富含多糖，而多糖的很多理化性質與RNA很相仿，因為這個很難將他們分開。在去除多糖的同時RNA也被裹攜走了，導致RNA產量的減損；而在沉澱RNA時，也萌生多糖的凝膠狀沉澱，這種包括多糖的RNA沉澱難溶於水，或溶解後萌生粘稠狀的溶液。因為多糖可以製約很多酶的活性，因為這個汙染了多糖的RNA樣品冇有辦法用於進一步的分子生物科學研討。在常理的辦法中，經過SDS-鹽酸胍處置可以局部去除一點多糖；在高液體濃度Na+或K+離子存在條件下，經過苯酚、氯仿抽提可以去掉除掉一點多糖；經過LiCl沉澱RNA也可以將局部多糖留在上清液中。但縱然經過這些個步驟仍會發覺有相當多的多糖與RNA混合摻雜在一塊兒，所以還需求用更管用的辦法來解決植物RNA離合醇化時多糖汙染的問題。

用低液體濃度酒精沉澱多糖是一個去除多糖效果較好的辦法。在RNA提出取得液或溶液中不迅速參加無薄酒精至終液體濃度10****-30****，可以使多糖沉澱下來，而RNA仍保存於溶液中。普通都是在植物材料的勻漿液中參加酒精，如在從被子植物的木質部中提出取得RNA時，在勻漿上清液中參加酒精至終液體濃度10****以沉澱多糖。但在從蒲桃漿果團體中提出取得RNA時，也可以在用CsCl超離心，酒精沉澱在這以後的RNA溶液中參加終液體濃度30****酒精來沉澱多糖的，進一步醇化了RNA樣品。

另一個常用的辦法是CH3COOH鉀沉澱多糖法。有科學研究擔任職務的人在提出取得雲杉團體的RNA時在勻漿上清液中參加1/3大小的5MCH3COOH鉀（pH4.8）溶液以沉澱多糖；一樣也有科學研究擔任職務的人在提出取得酸模植物花團體的RNA時參加的是1/5大小的5MCH3COOH鉀（pH4.8）溶液。這個之外，在提出取得草棉葉和花粉的RNA時是加1/3大小的8.5MCH3COOH鉀（pH6.5）溶液到勻漿液中以去掉除掉多糖等雜質。也可以在提出取得某些植物材料的RNA時，是將上麵所說的兩種辦法接合運用。如在提出取得杧果中果皮的RNA時，是在勻漿液中參加0.25大小的無薄酒精和0.11大小的5MCH3COOH鉀溶液以去除多糖雜質。不過在去除褐藻的多糖時，單獨運用酒精或CH3COOH鉀都失效，隻有兩者接合運用效果最佳。

緩和衝突液中包括高液體濃度的NaCl有助於去除多糖。在提出取得鬆樹RNA時，緩和衝突液中NaCl的液體濃度為2.0M和1.0M，經過氯仿抽提和酒精沉澱RNA將RNA與多糖離合。也可以將胡羅蔔胚珠等材料苯酚提出取得後的上清液稀釋，調節Na+離子液體濃度至80mM，而後參加0.4大小的2-丁氧氣酒精來沉澱去除多糖。

蛋白雜質的影響及對策

氨基酸是汙染RNA樣品的又一個關緊因素。因為RNase和多酚氧氣化酶亦歸屬氨基酸，故而要取得完整的、高品質的RNA就務必管用地去除蛋白雜質。常理的辦法是在冷凍的條件下研磨植物材料以製約RNase等的活性；提出取得緩和衝突液中包括氨基酸改變性彆劑，如苯酚、胍、SDS、十六烷基**基溴化銨（CTAB）等，這麼在勻漿時可以使氨基酸改變性彆，凝集；有的辦法是利用蛋白酶K來降解蛋白雜質。進一步可以用苯酚、氯仿抽提去除氨基酸。

額外，也可以利用氨基酸與RNA在高氯酸鈉溶液中的溶解度不一樣將他們離合。在70****高氯酸鈉溶液中，RNA的溶解度大於氨基酸的溶解度，故而將大多氨基酸沉澱下來。繼續在離心頭清液中參加兩倍大小的無薄酒精，這時RNA能沉澱下來而能溶於70****高氯酸鈉溶液中的**氨基酸還是留在上清液中。這麼可以去掉除掉絕大多的氨基酸。

次級代謝產物的影響及對策

從植物團體中提出取得高品質RNA的另一個不容易解決的地方是很多高等植物團體特彆是成熟團體能萌生某些水溶性的次級代謝產物，這些個次級代謝產物很容易與RNA接合並與RNA並肩被抽提出來而阻攔具備有生命的物質活性的RNA的離合。因不可以確認這些個次級產物具體是啥子事物，所以，到現在為止還冇有啥子特彆的辦法來解決這個問題。可以綜合挑選性沉澱法、氯化銫梯度離心法和RNA回借方法醇化了鬆樹胚珠、成熟鬆樹針葉等植物團體的RNA。

因為植物團體尤其是高等植物團體細胞裡外組成成分的複雜多樣性，要得植物團體RNA的提出取得相對於其他有生命的物質材料來說要艱難的多。實踐中常常會發覺，縱然同一栽種物的不一樣團體其RNA提出取得辦**有非常大的不一樣；包括某種乾擾因素的不一樣植物材料，其適合使用的RNA提出取得辦法有可能不一樣；縱然是同一栽種物同一種團體材料，但出處於不一樣基因型植株，其RNA提出取得辦法也有可能不同。所以，對於某一植物或其團體來說，其相應的RNA提出取得辦法不可少通過摸索和實踐能力穩固建立。

隨著植物分子生物科學研討領域的開拓，可以肯定地說，在作為其研討基礎的植物材料RNA提出取得過程中還會顯露出來新的不容易解決的地方，但隨著不停地考求和經驗的積累，科學辦公者們一定會速決這些個不容易解決的地方，為植物分子生物科學的進展鋪平道路。