双脱氧气链终止法标定DNA序列操作

日期：2025-05-01 12:37

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摘要：

双脱氧气链终止法标定DNA序列操作

DNA聚合酶催化的DNA链延伸是在3’-OH末端向上行的。因为2’，3’-双脱氧气三磷酸核苷酸(ddNTP)的3’-位脱氧气而错过游离-OH，当它参入到DNA链后，3’-OH末端消逝，使DNA链的延伸终止真空干燥箱。

本实验依据此原理，将待测DNA断片**去单链噬菌体M13载体，并用合成的寡聚核苷酸引物与该载体上**去待测断片的上游顺着次序退火，随即在T7DNA聚合酶催化下施行延伸反响。实际操作中同时施行，作别终止于A、G、C和T的4个反响整体体系。每个反响整体体系均含4种脱氧气三磷酸核苷酸(dNTP)底物，那里面—种dATP为32P标记物，以便能用放射自显影法读序。但在这4个反响整体体系中，作别加一种低液体浓度的ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP或ddTTP)，这么ddNTP可随机参入正在延伸的DNA链上，使链延伸终止。例如在“A”管中加ddATP，反响终了时，管内全部新合成的DNA链都是以A结末的不一样长度的断片，并且这些个断片都带放射性。将反响物加在高辩白凝胶上电泳，DNA断片则因其长度不一样(分子量体积不一样)被离合电热恒温鼓风干燥箱，短的走在前端，长的泳动在后面。其它3管则作别为以G，C或T结末的不一样长度DNA断片。

因为：①纵然是参差相差一个核苷酸的DNA断片，亦可依据其电泳距离的差别而加以区别；②A、G、C和T4种反响整体体系的产物在电泳凝胶中相邻排列。因而在阅览凝胶电泳的放射自显影图像时，由下至上按前后顺着次序即可将DNA的核苷酸顺着次序读出。